大巴車凌晨2點至5點在高速上必須休息。高速公路上，大巴車行駛時間過長會導致駕駛員疲勞，增加交通事故的風險。為了保障乘客和駕駛員的安全，相關規定強制要求大巴車在高速公路上必須進行休息。

具體規定如下：

1、長途客運車輛凌晨2時至5時停止運行或實行接駁運輸，凌晨2點后禁止長途客車從收費站口上高速，對此時間段內正在高速公路上行駛的長途客車就近引導到服務區或客運站停車休息。從事線路固定的機場、高鐵快線以及短途駁載且單程運營里程在100公里以內的客運車輛，在確保安全的前提下，不受凌晨2時至5時通行限制。                   

2、駕駛員連續駕駛4小時后，必須停車休息至少30分鐘。

3、大巴車行駛8小時后，必須停車休息至少1小時。這個規定是為了防止駕駛員長時間連續駕駛導致疲勞駕駛，減少交通事故的發生。